UJI KUANTITATIF BAKTERI DENGAN METODE POUR PLATE

PRAKTIKUM V

A. Judul Praktikum:  
UJI KUANTITATIF BAKTERI PADA BAHAN MAKANAN DENGAN METODE POUR PLATE 

B. Tujuan Praktikum
Untuk mengetahui jumblah bakteri pada bahan makanan dengan metoda pour plate 

C. Dasar Teori 
Metode cawan tuang sangat mudah dilakukan karena tidak membutuhkan keterampilan khusus dengan hasil biakan yang cukup baik. Metode ini dilakukan dengan mengencerkan sumber isolat yang telah diketahui beratnya ke dalam 9 ml garam fisiologis (NaCl 0.85%) atau larutan buffer fosfat. Larutan ini berperan sebagi penyangga pH agar sel bakteri tidak rusak akibat menurunnya pH lingkungan. Pengenceran dapat dilakukan beberapa kali agar biakan yang didapatkan tidak terlalu padat atau memenuhi cawan (biakan terlalu padat akan mengganggu pengamatan). Sekitar 1 ml suspensi dituang ke dalam cawan petri steril, dilanjutkan dengan menuangkan media penyubur (nutrien agar) steril hangat (40-50oC) kemudian ditutup rapat dan diletakkan dalam inkubator (37oC) selama 1-2 hari.
Penuangan dilakukan secara aseptik atau dalam kondisi steril agar tidak terjdi kontaminasi atau tumbuh atau masuknya organisme yang tidak diinginkan (di laboratorium, kontaminasi biasanya terjadi akibat tumbuhnya kapang, seperti Penicilium dalam biakan). Media yang dituang hendaknya tidak terlalu panas, karena selain mengganggu proses penuangan (media panas sebabkan tangan jadi panas juga), media panas masih mengeluarkan uap yang akan menempel pada cawan penutup, sehingga mengganggu proses pengamatan. pada metode ini, koloni akan tumbuh di dalam media agar. Kultur diletakkan terbalik, dimasukkan di dalam plastik dengan diikat kuat kemudian diletakkan dalam incubator.
Pada metode pour plate volume kultur sebanyak 0,1-1,0 ml diambil dan dimasukkan kedalam cawan petri steril. Kemudian ditambahkan media agar cair dan dilakukan pencampuran antara kultur dan media dengan memutar cawan petri secara pelan pada permukaan yang rata. Karena sampel dicampur dengan media agar cair maka volume kultur yang digunakan dapat lebih tinggi dibanding dengan metode spread plate. Pada pengujian dengan metode pour plate, kultur/sampel mikroba yang digunakan harus dapat bertahan hidup pada saat media agar dengan suhu sekitar 45 0C ditambahkan. Didalam penggunaan metode spread plate dan pour plate sangat penting jika jumlah koloni yang tumbuh pada media agar tidak terlalu banyak, karena pada petri yang ditumbuhi koloni yang banyak, beberapa sel tidak dalam bentuk koloni tunggal sehingga dapat menimbulkan perhitungan yang salah. Jumlah koloni yang sangat sedikit juga tidak diharapkan karena secara statistik keakuratan hasil perhitungan jumlah koloni ini sangat rendah. Dalam penerapannya, secara statistik yang paling baik adalah menghitung jumlah koloni hanya jika pada media agar terdapat koloni antara 30 – 300 koloni.

Untuk memperoleh jumlah koloni yang tepat, sampel yang akan dianalisa harus selalu diencerkan terlebih dahulu. Karena dalam penerapannya sangat sulit dilakukan pendugaan jumlah sel maka biasanya sangat penting untuk melakukan pengenceran lebih dari satu.

D. Alat dan Bahan
1. Alat : Vortex, petridish, Erlenmeyer , Dispo, incubator, autoklaf, mortar, Colini counter, Bunsen, Neraca Ohaus, dan Tabung reaksi.
2. Bahan : NaCL fisiologis, aquades steril, NA ( Nutrien Agar ), alcohol 70 % dan bahan makanan ( daging, ikan kaleng ,telur, ikan asin, ikan asap. ).

E. Prosedur Kerja
1. Mengambil bahan makanan yang akan di uji seberat 1 gram lalu masukkan ke dalam mortar steril dan menghaluskan, lalu mengambil bahan makanan yang sudah dihaluskan tadi sebanyak 1 gr kemudian memasukkannya kedalam larutan NaCL fisiologi steril sebanyak 10 ml, suspensi yang diperoleh dipindahkan kedalam tabung steril dan di vortex sampai homogen.

2. Dari suspensi yang tersedia diambil sebanyak 1 ml dengan menggunakan dispo dan mengencerkan menjadi 1 ; 10 dengan menambahkan NaCL fisiologi sebanyak 9 ml, selanjutnya dibuat pengenceran 1 : 100 , yaitu mengambil 1 ml dari hasil pengenceran sebelumnya ( 1 : 10 ) dan ditambahkan NaCL fisiologi sebanyak 9 ml. demikian seterusnya dibuat sampai pengenceran yang diinginkan.

3. Setelah itu dari masing – masing pengenceran di ambil suspense sebanyak 1 ml dan memindahkan kedalam cawan petri kemudian memasukkan media NA yang bersuhu ± 45 0C kemudian digerakkan perlahan – lahan agar suspense tersebut tercampur rata ke dalam media.

4. Selanjutnya menginkubasi dalam incubator dengan suhu 37 0C selama 1 x 24 jam dengan posisi cawan petri dalam keadaan terbaik.

5. Menghitung jumlah koloni yang terdapat di cawan petri kemudian hitung jumlah sel bakteri pada bahan makan dengan menggunakan rumus sebagai berikut :
Koloni per ml / per gr = jumlah koloni percawan x 1/ Factor pengenceran
 
F. Hasil Pengamatan
Cawan petri yang telah di inkubasi didalamnya terdapat mikroba.
Dari percobaan yang kami lakukan kami maendapatkan hasil :


PENGENCERAN JUMLAH KOLONI BENTUK PERMUKAAN BENTUK PINGGIR
10-1 40 Datar Agak Bergerigi & melengkung
10-2 20 Datar Agak Bergerigi & melengkung
10-3 13 Datar Melengkung

G. Pembahasan
Pada metode pour plate volume kultur sebanyak 0,1-1,0 ml diambil dan dimasukkan kedalam cawam petri steril. Kemudian ditambahkan media agar cair dan dilakukan pencampuran antara kultur dan media dengan memutar cawan petri secara pelan pada permukaan yang rata. Karena sampel dicampur dengan media agar cair maka volume kultur yang digunakan dapat lebih tinggi dibanding dengan metode spread plate.
Pada pengujian dengan metode pour plate, kultur/sampel mikroba yang digunakan harus dapat bertahan hidup pada saat media agar dengan suhu sekitar 45 0C ditambahkan. Didalam penggunaan metode spread plate dan pour plate sangat penting jika jumlah koloni yang tumbuh pada media agar tidak terlalu banyak, karena pada petri yang ditumbuhi koloni yang banyak, beberapa sel tidak dalam bentuk koloni tunggal sehingga dapat menimbulkan perhitungan yang salah. Jumlah koloni yang sangat sedikit juga tidak diharapkan karena secara statistik keakuratan hasil perhitungan jumlah koloni ini sangat rendah. Dalam penerapannya, secara statistik yang paling baik adalah menghitung jumlah koloni hanya jika pada media agar terdapat koloni antara 30 – 300 koloni. Untuk memperoleh jumlah koloni yang tepat, sampel yang akan dianalisa harus selalu diencerkan terlebih dahulu. Karena dalam penerapannya sangat sulit dilakukan pendugaan jumlah sel maka biasanya sangat penting untuk melakukan pengenceran lebih dari satu.
Untuk membuat pengenceran 10-1 maka kita dapat melakukan pencampuran antara 0.5 ml sampel dengan 4.5 ml larutan pengencer atau dengan pencampuran 1.0 ml sampel dengan 9.0 ml larutan pengencer. Untuk membuat pengenceran 10-2 maka kita dapat melakukan pengenceran 0.05 ml sampel dengan 4.95 larutan pengencer atau 0.1 sampel dengan 9.9 ml larutan pengencer atau sebagai alternatif pengenceran 10-2 dapat dibuat dengan melakukan pencampuran 1,0 sampel (yang diambil dari pengenceran 10-1) dengan 9,0 ml larutan pengencer, dan begitu seterusnya hingga didapatkan pengenceran yang diperkirakan dapat memberikan hasil antara 30-300 koloni. Jumlah koloni dalam sampel dapat dihitung sebagai berikut :
Koloni per ml / per gr = jumlah koloni percawan x 1
Factor pengenceran
Pada pengenceran 10-1 dengan jumlah 40 koloni dapat dihitung koloni dalam sampel yaitu :
40 x 1 = 400 koloni/ml
10-1

H. Kesimpulan
Jumlah koloni yang diperoleh dengan menggunakan metode ini tidak hanya bergantung pada jumlah inokulum tetapi juga kesesuaian media dan kondisi inkubasi yang digunakan dan juga bergantung pada lama waktu inkubasi. Sel yang ditumbuhkan pada media tidak seluruhnya akan tumbuh menjadi koloni pada tingkat yang sama, dan jika waktu inkubasi yang digunakan pendek maka jumlah koloni yang diperoleh mungkin lebih rendah dari jumlah maksimum koloni yang dapat terbentuk. Sebagai catatan sangat mungkin dua atau lebih sel dapat membentuk hanya satu koloni, sehingga untuk menggambarkan hasil yang didapatkan maka viable count lebih dinyatakan sebagai jumlah colony-forming unit dibanding dinyatakan sebagai jumlah viable cell (karena koloni yang terbentuk mungkin mengandung lebih dari satu sel mikroba)


I. Jawaban pertanyaan
1. kelebihan dan kekurangan dari metode pour plate
Kelebihan Kelemahan
 Hanya sel yang masih hidup yang dihitung
ü Beberapa jenis mikroba dapat dihitung sekaligus
ü  HasilüDapat digunakan untuk isolasi dan identifikasi mikroba  perhitungan tidak menunjukkan jumlah sel sebenarnya, karena beberapa sel yang berdekatan mungkin akan membentuk satu koloni
 Medium dan kondisi inkubasi yang berbeda mungkin menghasilkan nilai yang berbedaü
 Mikroba yang ditumbuhkan harus dapat tumbuh pada medium padat dan membentuk koloni yang jelasü
 Memerlukan persiapan dan waktu inkubasi relative lama sehingga pertumbuhan koloni dapat dihitungü
2. Aturan-aturan dalam standar plate count (SPC)
- Jumlah Koloni 30—300 koloni
- Beberapa jumlah koloni yang bergabung dihitung satu koloni
- Gabungan satu garis tebal dihitung satu koloni
- Jika lebih kecil dari 30 koloni, pengenceran terendah yg dihitung
- Jika lebih besar dari 300 koloni, pengenceran tertinggi yg dihitung
- Jika antara 30-300 dari dua tingkat pengenceran dan perbandingan antara hasil tertinggi dan terendah dari pengenceran tsb lebih kecil atau = 2, dilaporkan rata-ratanya. Jika lebih besar dari 2 maka yang dilaporkan adalah hasil yang terkecil.


J. Daftar pustaka
GAUTHIER . M and BLAIS. B.W. 2005. CLOTH-BASED HYBRIDIZATION ARRAY SYSTEM FOR DETECTION OF TOXIN GENES ASSOCIATED WITH MAJOR FOODBORNE PATHOGENIC BACTERIA. Journal of Rapid Methods and Automation in Microbiology 13 (2005) 243–256. Blackwell Publishing
 
HSIN-YI PU and SHAW-JYE WU. 2005. A MICROTRAY-BASED AGGREGATION ASSAY FOR THE RAPID DETECTION OF POLYMERASE CHAIN REACTION AMPLICONS PRODUCED FROM BACTERIAL PATHOGENS. Journal of Rapid Methods and Automation in Microbiology 13 (2005) 257–268. Blackwell Publishing.
 
Irwin. P, et al. 2005. LUMINESCENT METHODS TO DETECT VIABLE AND TOTAL
 
Campylobacter jejuni IN GROUND BEEF. Journal of Rapid Methods and Automation in Microbiology 13 (2005) 57–70. Blackwell Publishing

Posted by Unknown on - Rating: 4.5

Title : UJI KUANTITATIF BAKTERI DENGAN METODE POUR PLATE
Description : PRAKTIKUM V A. Judul Praktikum:   UJI KUANTITATIF BAKTERI PADA BAHAN MAKANAN DENGAN METODE POUR PLATE   B. Tujuan Praktikum Untuk me...

Tweet